這篇推文將對高效液相色譜法（HPLC）做一個簡單的介紹，讓初步接觸液相色譜知識的人員有一個資料進行閱覽，如果有不嚴密的地方請包涵。

色譜法是一種利用物質(zhì)的溶解性、吸附性等理化性質(zhì)將混合物分離成不同組分的方法。這涉及到固定相（固體或附著在固體上的液體）和流動相（液體或氣體）。流動相流經(jīng)固定相，并攜帶混合物中的成分，與固定相相互作用較強的樣品成分通過色譜柱的速度比相互作用較弱的成分慢；這種速度上的差異會導(dǎo)致各種成分的分離。色譜法按流動相和固定相的狀態(tài)分為氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、凝膠色譜、超臨界流體色譜等。

液相色譜法的歷史可以追隨到20世紀初期。1906年俄羅斯的科學(xué)家茨維特（Tswett）為了分析從植物葉子中提取的色素，把溶解了植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗。因為是玻璃管，所以可以清楚地觀察管中的情況。隨著時間的推移，色素從碳酸鈣的縫隙中緩緩地往下流動，最后分成了顏色不同的4層（如圖所示）。

經(jīng)過后來的研究，這4個層次中，青綠色的是葉綠素a，黃綠色的是葉綠素b，黃色的是黃嘌呤，橙色的是胡蘿卜素。這就是液相色譜的起源。但實際上，色素的四種成分從玻璃管中分離需要幾個小時的時間，并不是非常實用的方法。液相色譜正式在各個領(lǐng)域運用是從此后半個世紀后的1970年左右開始的。

高效液相色譜法（HPLC）基本上是柱式液相色譜法的一種高度改進形式。溶劑不是在重力作用下滴過色譜柱，而是在高達 400 個大氣壓 (psi) 的高壓下強制流過，包括 HPLC 在內(nèi)的所有色譜分離都遵循相同的基本原理：由于不同分子對流動相和分離所用固定相的相對親和力不同，因此可將樣品分離成不同的組分。

根據(jù)工藝中的相系統(tǒng)（固定），HPLC 有以下幾種類型：

正相 HPLC ：這種方法根據(jù)極性分離分析物。NP-HPLC 使用極性固定相和非極性流動相。因此，固定相通常為硅膠。典型的流動相有正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。因此，極性樣品會被保留在色譜柱的極性表面上，比極性較弱的物質(zhì)保留時間更長。

反相 HPLC ：固定相為非極性（疏水性），流動相為極性液體，如水和甲醇或乙腈的混合物。其工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強，保留時間就越長。

體積排阻 HPLC ：色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據(jù)其分子尺寸被分離。較大的分子會迅速通過色譜柱；較小的分子則會滲入填料顆粒的多孔內(nèi)部，隨后洗脫出來。

離子交換 HPLC：固定相表面帶有與樣品離子電荷相反的離子電荷。這種技術(shù)幾乎只用于離子或可離子化的樣品。樣品上的電荷越強，其被離子表面吸引的程度也就越強，因此洗脫時間也就越長。流動相是一種水性緩沖液，pH 值和離子強度都用于控制洗脫時間。

HPLC 儀器包括輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)采集（處理）系統(tǒng)（如圖所示），其中系統(tǒng)的核心是進行分離的色譜柱。

泵是HPLC系統(tǒng)中設(shè)置在最上方，把流動相從溶液瓶中輸送到系統(tǒng)中的裝置。HPLC開發(fā)初期達到高壓力是泵的關(guān)鍵點，然而如今要保證高壓力顯然輕而易舉，所以對泵的要求變成了在任何條件下都能保持壓力和流動相流速的穩(wěn)定。（流動相流速的變化會對測定的結(jié)果造成不良影響）

大多數(shù)的泵，由于是利用類似于活塞運動那樣的往復(fù)運動，會對應(yīng)往復(fù)運動的周期而產(chǎn)生壓力變動（這里稱為脈動）。為了減少這種脈動，花了很多功夫，如今的泵產(chǎn)生的脈動已經(jīng)非常少了。然而，進行從前無法想象的微量樣品高敏感度分析時，僅僅很小的流速變化都會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。所以，進行高靈敏度分析時需要更高精度的泵。

進樣器是設(shè)置在泵之后，把需要分析的樣品注入流動相的裝置。最近，可以把多種樣品以一定時間間隔連續(xù)注入系統(tǒng)的自動進樣器也被廣泛的使用。

如今的色譜柱和茨維特實驗使用的填滿碳酸鈣的玻璃管的原理一樣，但是柱子的材質(zhì)由玻璃管換成了不銹鋼管，中間的填料可以使用硅膠基質(zhì)填料和聚合物基質(zhì)填料。因為樣品是在色譜柱中進行分離，所以說色譜柱是整個HPLC系統(tǒng)中最重要的組成部分。

廣州研創(chuàng)的色譜柱產(chǎn)品圖

HPLC使用的流動相，從酸性到堿性各種各樣的溶劑都有。由于不銹鋼對各種溶劑的耐受性都較好，所以HPLC用色譜柱大多使用不銹鋼材質(zhì)制成。然而，分析生化或者離子樣品時，樣品不能和金屬接觸，所以這種場合需要使用玻璃或者PEEK（聚醚醚酮樹脂）材質(zhì)的色譜柱。

樣品的分離在色譜柱中進行，而分離后的結(jié)果需通過檢測器才能轉(zhuǎn)換成可以觀察的形式。不含有樣品的流動相的組成是一定的，流動相中包含了樣品其組成就會發(fā)生改變，檢測器可以將這種變化轉(zhuǎn)化為電子信號。檢測器根據(jù)不同的檢測方法分為很多種類，常用的檢測器有紫外吸收檢測器、熒光檢測器、質(zhì)譜檢測器和電化學(xué)檢測器。

即使使用檢測器把檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化為了電子信號，也仍然不是能觀察的形態(tài)。為了使其可被分析觀察，以前是使用類似筆形記錄器的裝置，現(xiàn)在則使用基于電腦技術(shù)的數(shù)據(jù)處理器（也叫積分儀）。數(shù)據(jù)處理器從內(nèi)藏打印機的文字處理器這種簡易型式開始，已經(jīng)發(fā)展成顯示器、鍵盤、打印機各部分獨立的類似電腦的形式，種類繁多。而且，如今還有出售專門的電腦用HPLC分析軟件以及使用USB接口，即使是筆記本電腦也能簡單提取數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。

以上介紹的部分，都是HPLC系統(tǒng)最基礎(chǔ)的部件。

高效液相色譜法（HPLC）已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。此外，高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學(xué)分離和純化。高效液相色譜的其他應(yīng)用包括：

制藥應(yīng)用：控制藥物穩(wěn)定性、藥物劑型的片劑溶出度研究、藥品質(zhì)量控制等。

環(huán)境應(yīng)用：檢測飲用水中的酚類化合物、污染物的生物監(jiān)測等。

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：生物樣本中的藥物定量、鑒定血液、尿液等中的類固醇、紡織品染料的法醫(yī)分析、測定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物等。

食品和香料：軟飲料和水的質(zhì)量測定、果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析、防腐劑分析等。

在臨床檢驗中的應(yīng)用：尿液分析、血液中的抗生素分析、肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析、檢測腦細胞外液中的內(nèi)源性神經(jīng)肽等。